qPCR-menetelmien kehittäminen ja validointi Nosema apis-, Nosema ceranae- ja Nosema bombi -loisten pitoisuuksien määrittämiseksi mehiläisissä

Tässä tutkimuksessa kehitetään ja validoidaan spesifisiä, herkkiä ja tarkkoja koettimipohjaisia reaaliaikaisia qPCR-menetelmiä kolmen tärkeimmän mehiläisiä tartuttavan mikrosporidian – Nosema apis, Nosema ceranae ja Nosema bombi – hunajamehiläisissä (Apis mellifera), kimalaisissa (Bombus terrestris) ja muurahaismeehiläisissä (Osmia bicornis). Määritykset kohdistuvat yksikappaleiseen, erittäin konservoituneeseen RPB1-geeniin, ja niillä saavutetaan korkea tehokkuus (95–110 %), pieni vaihtelu sekä havaitsemisrajat välillä 2,0–4,0 log10 kopiota mehiläistä kohti. Menetelmät osoittavat spesifisyyttä, kattavuutta ja luotettavuutta kaikissa kolmessa mehiläislajissa, ja niiden validoidut kvantifiointialueet hunajamehiläisillä ovat 4–10,3 log10 kopiota/mehiläinen. Raakojen Cq-arvojen systemaattiset harhat korjattiin, mikä paransi merkittävästi tarkkuutta ja täsmällisyyttä ja täytti Ranskan standardien vaatimukset oikeellisuudesta ja toistettavuudesta. Tämä lähestymistapa ylittää monikopioisten rRNA-geenien rajoitukset käyttämällä yksikopioisia kohteita, mikä parantaa diagnoosin luotettavuutta. Menetelmät soveltuvat suurikapasiteettiseen seulontaan ja tukevat tutkimusta virusten ja muiden patogeenien aiheuttamista yhteisinfektioista, mikä mahdollistaa loisten dynamiikan ja mehiläisten terveysriskien paremman arvioinnin. Tutkimus tarjoaa yhdenmukaistetun ja validoidun molekyylityökalupakin nosemoosin seurantaan ja ekologisiin tutkimuksiin sekä kasvatetuissa että luonnonvaraisissa pölyttäjähyönteisissä.